Biotecnologías del embrión bovino al servicio de los ganaderos

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Una mirada de las técnicas disponibles en Francia

Giselle Gamarra 1 y Serge Lacaze 2

1 Ing. MSc. PhDc Especialista en Biotecnologías Reproductivas, Departamento I&D UNCEIA, MIDATEST, Francia. giselle.gamarra@unceia.fr ; giselle.gamarra@midatest.fr

2 Ing. MSc. Responsable de Biotecnologías Reproductivas en MIDATEST, Miembro de Consejo de Administración de la Asociación Europea de Transferencia Embrionaria serge.lacaze@midatest.fr

Introducción

Las biotecnologías reproductivas relacionadas al embrión bovino representan hoy herramientas importantes para el mejoramiento genético de esta especie. Estas técnicas tienen como objetivo acelerar el progreso genético multiplicando de una manera más rápida las mejores hembras bovinas, madres de futuros reproductores que formarán parte los centros de inseminación, así como las mejores hembras bovinas de los ganaderos.

El presente artículo tiene como objetivo describir de una manera sencilla las principales biotecnologías reproductivas que actualmente están disponibles para beneficio de los ganaderos franceses y que representan un reto a seguir de organización y plan a largo plazo en otros países donde se quiera realizar programas de mejoramiento genético a fin de multiplicar las mejores vacas del país e incorporar razas o animales genéticamente mejorados de otros países y asimismo obtener las mejores descendencias de estos animales.

El artículo presentará en una primera parte las técnicas de producción de embriones in vivo y transferencia embrionaria, así como el sexado de embriones y en otra segunda parte se presentarán las técnicas de producción de embriones in vitro por la técnica OPU-FIV  y la selección genómica de los embriones. Asimismo, se hablará sobre la técnica de clonación que es  utilizada actualmente en Francia con fines de investigación y que ayuda a comprender mejor la interacción entre el potencial genético y el medio ambiente.

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Esta técnica consiste en luego de un proceso de superovulación colectar embriones del cuerno uterino de una hembra llamada donadora, clasificar los embriones de acuerdo a su calidad y transferirlos individualmente en el cuerno uterino de otras hembras denominadas receptoras para completar su gestación (Figura 1).

Tabla 1. Producción de embriones in vivo a nivel mundial año 2011.

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A nivel mundial es Norte América el continente que más actividad tiene de transferencia embrionaria seguido por Europa y en tercer lugar Asia (Tabla 1). Entre los países europeos se encuentra Francia en primer lugar de producción de embriones, seguido por Holanda y en tercer lugar Alemania (Tabla 2).

Tabla 2. Los once primeros países europeos clasificados por número de embriones obtenidos in vivo transferidos en 2011 .

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En Francia, la actividad de producción y transferencia de embriones es practicada desde el año 1979 y a fin de otorgar toda la garantía a los ganaderos su funcionamiento es totalmente reglamentado y controlado por el Ministerio de Agricultura. Esta actividad puede ser practicada solamente por equipos aprobados por el Ministerio de Agricultura francés. Actualmente, 30 equipos de transferencia embrionaria son aprobados por el Ministerio de Agricultura y la mayoría trabaja en estrecha asociación con las cooperativas de crianza y de inseminación artificial.

Como hemos visto en los cuadros anteriores, la actividad de TE en Francia ocupa un lugar bastante importante a nivel mundial, tanto por su tecnología así como por la importancia económica que representa. En el año 2012 se han colectado aproximadamente 7 000 donadoras y transferidos 35 000 embriones, representando un promedio de 40% de la actividad europea.

Si bien la inseminación artificial representa la primera herramienta de reproducción capaz de tener un progreso genético importante, la transferencia embrionaria constituye una herramienta complementaria, puesto que cuando su empleo es bien razonable, permite aumentar la velocidad del progreso genético. Es por esta razón que esta técnica  es particularmente utilizada en los esquemas de selección genética.

Como promedio de la producción de embriones in vivo se obtienen 10 embriones por colecta, de los cuales 5,5 pueden ser congelados o transferidos. La tasa de gestación de los embriones transferidos es del 60% para embriones frescos y de 50% para los embriones congelados.

La técnica de la transferencia de embriones incluye varias etapas, desde la superovulación de donadoras hasta la transferencia del embrión. Las principales etapas relacionadas son:
a) La superovulación

La superovulación es provocada gracias a la inyección 2 veces al día, durante 4 días de preparaciones conteniendo hormonas folículos estimulante (FSH) provenientes de extractos purificados de la hipófisis porcina en donde la inocuidad ha sido controlada. En promedio, el número de ovulaciones observadas después de tratamientos con FSH es del orden de 12, sin embargo; existe una gran variabilidad individual que es imposible de predecir (con variaciones que van de 0 a 50 ovulaciones). Casi un 15% de hembras no tendrán una cantidad  de ovulaciones suficientes para esperar obtener un ternero.

b) La colecta de embriones

La colecta de embriones se efectúa el séptimo día en promedio después de la inseminación artificial de la hembra donadora. Esta técnica es realizada mediante la introducción de una catéter por la cérvix o cuello uterino de la hembra hasta llegar al cuerno uterino y fijarse en este lugar por intermedio de un balón (que se infla de aire) que posee el catéter. Es una técnica delicada, que requiere de habilidad y experiencia. La operación dura en promedio media hora. El proceso consiste en inyectar y recuperar un líquido tampón en la cavidad uterina para enjuagar y recuperar los embriones presentes en el cuerno uterino. Después de la colecta, los embriones son recuperados por filtración o decantación y luego son buscados en estereoscopios.

c) La apreciación de la calidad de embriones

Esta etapa es esencial, pues de la buena clasificación y control sanitario dependerán las tasas de preñez y garantizar el aspecto sanitario requerido. Los embriones son observados a través de un estereoscopio y su calidad es estimada según sus aspectos morfológicos en función del día de inseminación y en función de la integridad de la zona pelucida que protege al embrión.

Existe una clasificación oficial realizada por la IETS (Asociación Internacional de Transferencia de Embriones), clasificando embriones de calidad 1 (excelentes y buenos) a 4 (embriones degenerados u ovocitos no fecundados).

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Figura 2. Embriones obtenidos después de una colecta embrionaria realizada el día 7.

d) Lavado y conservación de embriones

El lavado de los embriones se realiza en una solución tampón fosfato con proteínas, son 10 lavados sucesivos exigidos de forma obligatoria. Esto garantiza a los ganaderos de tener embriones libres de gérmenes patógenos.

Los embriones son lavados y enseguida conservados a temperatura ambiente durante un corto periodo de tiempo antes de su transferencia o sometidos a conservación a temperaturas de refrigeración 6°C, máximo por un día o en nitrógeno líquido a -196 °C . En este último caso el embrión es conservado en un medio conteniendo, un crioprotector. Después de 1995, en Francia se utiliza un método de congelación a base de etilen glicol como crioprotector permitiendo la transferencia directa del embrión en receptoras después de la descongelación. Este método es actualmente el más común utilizado a nivel mundial y no requiere la manipulación de embriones antes de su transferencia. La transferencia directa puede ser realizada por técnicos especializados, por ejemplo técnicos inseminadores que han aprendido a realizar la transferencia embrionaria.

e) La transferencia de los embriones

Los embriones son transferidos individualmente en el útero de una hembra receptora donde su ciclo estral ha sido sincronizado perfectamente con la de la donadora. La transferencia se realiza por vía cervical, introduciendo la pistola de transferencia hasta llegar al cuerno uterino.

El sexaje de embriones

La técnica de sexado de embriones utilizada en Francia fue desarrollado por el Instituto Nacional de Investigación Agronomía (INRA), los laboratorios Mérieux y la UNCEIA en el año 1990. La técnica consiste en realizar una biopsia del embrión (conteniendo unas pocas células) por micromanipulación bajo microscopio. El sexado de la biopsia se determina por extracción ADN, la amplificación de una secuencia específica del ADN masculino del cromosoma Y y de una secuencia autosomal, por la técnica de PCR. La detección del ADN amplificado se realiza por electroforesis.

La fiabilidad de esta técnica desarrollada en Francia es confirmada por los resultados de más de 3000 embriones sexados:

-       96% de eficacidad (solo 4% de embriones sometidos a la prueba son indeterminados).

-       98% de exactitud (98% de terneros son exactamente del sexo esperado).

-       Las tasas promedio de preñez varían según el modo de conservación de los embriones biopsiados:

  • 55 a 60% de preñez para los embriones transferidos en fresco.
  • 45 a 50% de preñez para los embriones transferidos después de descongelación.

La calidad de la receptora es igualmente un factor de variación importante, las tasas de gestación son en promedio 10% más elevadas en vaquillas que en vacas.

Después de 1991, los kits de sexaje son fabricados, controlados y administrados por la UNCEIA a los diferentes equipos de transferencia embrionaria en Francia.

Etapas de la técnica de sexaje de embriones

a)    La Biopsia

Antes de realizar la biopsia, los embriones colectados son lavados 10 veces en la solución tampón fosfato con proteínas, según las condiciones sanitarias reglamentarias y clasificados por criterios morfológicos. Solamente los embriones considerados como excelentes o de buena calidad y dentro de su zona pelucida, son seleccionados para la biopsia.

La técnica consiste en retirar entre 5 a 10 células en promedio en un embrión que contiene entre 60 a 80 células, con la ayuda de 2 micromanipuladores, uno para mantener el embrión y el otro para cortar con un micro-cuchillo, el proceso se realiza bajo observación microscópica. La biopsia es depositará en un tubo pequeño debidamente identificado por el número del embrión y es en este tubo donde se realizarán las principales etapas de la determinación del sexo (Figure 3 y 4).

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b)    La determinación del sexo

La técnica de sexaje reposa en la detección de una secuencia específica del ADN en el cromosoma Y bovino después hibridación por una sonda especifica y amplificación de esta secuencia con la ayuda de un método de laboratorio llamado PCR (Reacción en cadena de polimerasa) (Figura 5). El ADN específico amplificado es luego separado por la técnica de electroforesis en un gel de agarosa. La observación del gel fluorescente permite de visualizar la banda específica de la presencia del cromosoma Y en las células provenientes de un embrión macho. La ausencia de esta banda permite de afirmar que las células provienen de un embrión hembra. Una secuencia común a los dos sexos permite de controlar la presencia de la biopsia en el tubo de sexage (Figura 6).

Las operaciones de micromanipulación y de sexaje deben de realizarse por personal capacitado y competente que respeten estrictamente las condiciones sanitarias y técnicas.

Asimismo, las operaciones de biopsia y de sexaje pueden realizase en las mismas ganaderías dado que la organización para la puesta en marcha de esta técnica se ha simplificado. En efecto, el tiempo necesario para realizar el sexaje es alrededor de 2 horas a este tiempo hay que añadir el tiempo de realizar las biopsias de los embriones colectados, que debe estar limitado a 1h30 como máximo.

Como se mencionó anteriormente es igualmente posible de congelar los embriones biopsiados de esta manera los embriones sexados son congelados y posteriormente los embriones solo del sexo deseado son transferidos en receptoras por el método de transferencia directa.

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Figura 6. Dos geles de agarosa luego de la electroforesis mostrando la cantidad de machos y hembras por fluorescencia. Podemos observar 4 machos presentes en el primer gel y 7 machos en el segundo gel.

Referencias bibliográficas

Lacaze S, Humblot, P, Ponsart C. 2008. Sexage et Transfer direct d’embryos bovines biopsies et congèles en ferme dans un programme commercial. 15 Congrès International 3R Rencontres, Recherches Ruminants.

UNCEIA, 13 Rue Jouët, 94704 Maisons Alfort, France. http://www.unceia.fr/

MIDATEST, Domaine de Sensacq, 64230 Denguin, France http://www.midatest.fr/

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Categories  AGRO ENFOQUE biotecnologia ganado

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